微生物所研究人员获得可同等高效利用NADH和NADPH的脱氢酶
脱氢酶是在化学品生物合成中具有重要作用,它们的催化作用一般都需要有还原型辅酶NADH或NADPH的参与。自然界中的脱氢酶多以NADH作为辅因子,也有一些脱氢酶以NADPH作为辅因子。由于酶催化的专一性,依赖于NADH的脱氢酶一般不能利用NADPH,反之亦然。自然界中,既有富含NADH的微生物,也有富含NADPH的微生物。如果能获得同等利用NADH和NADPH的脱氢酶,则有利于降低生物催化反应对宿主的依赖性。
已有很多研究尝试去改变脱氢酶对还原型辅酶的偏好性。依赖于NADH的脱氢酶经改造后,能够以NADPH为辅因子,但活性很低,而且对NADH的活性也显著下降,使得这些改造后的酶不具有实际应用价值。因此,能否在改造脱氢酶辅因子偏好性的同时,保持其酶活不降低,是一个重要的科学挑战。
微生物研究所李寅研究员、周杰副研究员与南开大学林建平教授合作,选择一个活性最高的NADH依赖型D-乳酸脱氢酶(D-LDH),开展辅因子偏好性改造研究。为了最大程度减小对原有辅因子催化活性的影响,研究人员通过数据库搜索、计算机模拟、蛋白结构比对分析,发现了还原型辅酶结合口袋差异最小的两个环:YDIFR和YSRTR(如图所示)。两者首尾相同,只有中间三个氨基酸有区别。基于这一发现,研究人员推测,用结合NADPH的YSRTR环,替代D-LDH上结合NADH的YDIFR环,有可能提高对NADPH的活性,但不会显著降低对NADH的活性。
根据这一假设,研究人员在D-LDH中引入三个氨基酸突变D176S、I177R、F178T,获得改造后的D-LDH*。结果显示,不仅D-LDH*对NADPH的活性大幅度提高(与改造前D-LDH对NADH的活性相当),而且D-LDH*仍然可以高效利用NADH为辅因子。酶动力学参数分析显示,D-LDH*对NADPH的Kcat/Km是改造前的184倍;而D-LDH*对NADH的Kcat/Km也比改造前提高了50%。这是通过理性设计改造,第一次使乳酸脱氢酶能够同等、高效利用NADH和NADPH。
该工作的完成为D-乳酸的生物合成提供了一个功能拓展的新酶,已申请中国专利,并于4月25日在线发表在自然出版集团的Scientific Reports上。第一作者为微生物所-中国科技大学联合培养博士生蒙恒凯和天津工业生物技术所刘岯博士。该研究得到“低阶煤清洁高效梯级利用关键技术与示范”A类先导专项的资助。
全文链接: http://www.nature.com/articles/srep24887
图示 两种辅因子结合口袋中差异最小的两个环与其辅因子相互作用分析
(a) NADH依赖型脱氢酶晶体结构1J49中177-环(YDIFR)与NAD+相互作用分析;
(b) NADPH依赖型脱氢酶晶体结构2DBQ中181-环(YSRTR)与NADP+相互作用分析。
责编 :宋超